Em setembro de 1888 foi organizado o Sínodo da Igreja Presbiteriana do Brasil, que se tornou assim autônoma, desligando-se das igrejas-mães norte-americanas. O Sínodo compunha-se de três presbitérios (Rio de Janeiro, Campinas-Oeste de Minas e Pernambuco) e tinha vinte missionários, doze pastores nacionais e cerca de sessenta igrejas. O primeiro moderador foi o veterano Rev. Blackford. O Sínodo criou o Seminário Presbiteriano, elegeu seus dois primeiros professores e dividiu o Presbitério de Campinas e Oeste de Minas em dois: São Paulo e Minas.

Nesse período, a denominação expandiu-se grandemente, com muitos novos missionários, pastores brasileiros e igrejas locais. O seminário começou a funcionar em Nova Friburgo, no final de 1892, e no início de 1895 transferiu-se para São Paulo, tendo à frente o Rev. John Rockwell Smith. O Mackenzie College ou Colégio Protestante foi criado em 1891, sendo seu primeiro presidente o Dr. Horace Manley Lane. Por causa da febre amarela, o Colégio Internacional foi transferido de Campinas para Lavras, e mais tarde veio a chamar-se Instituto Gammon, numa homenagem ao seu grande líder, o Rev. Samuel R. Gammon (1865-1928).

A primeira escola evangélica do nordeste foi o Colégio Americano de Natal (1895), fundado por Katherine H. Porter, esposa do Rev. William C. Porter. Na mesma época, a cidade de Garanhuns começou a tornar-se um grande centro da obra presbiteriana. Além do trabalho evangelístico, foram lançadas as bases de duas importantes instituições educacionais: o Colégio Quinze de Novembro e o Seminário do Norte, hoje sediado em Recife. No final desse período, além de estar presente em todos os estados do nordeste, a Igreja Presbiteriana chegou ao Pará e ao Amazonas.

No sul, foi iniciada a obra presbiteriana em Santa Catarina (São Francisco do Sul e Florianópolis). A igreja também iniciou a sua marcha vitoriosa no leste de Minas. O primeiro obreiro a residir em Alto Jequitibá foi o Rev. Matatias Gomes dos Santos (1901). As igrejas de São Paulo e do Rio de Janeiro passaram a ser pastoreadas por dois grandes líderes, respectivamente Eduardo Carlos Pereira (1888) e Álvaro Emídio G. dos Reis (1897).

Infelizmente, os progressos desse período foram em parte ofuscados por uma grave crise que se abateu sobre a vida da igreja. Inicialmente, surgiu uma diferença de prioridades entre o Sínodo e a Junta de Missões de Nova York. O Sínodo queria apoio para a obra evangelística e para instalar o Seminário, ao passo que a Junta preferia dar ênfase à obra educacional, principalmente por meio do Mackenzie College. Paralelamente, surgiram desentendimentos entre o pastor da Igreja Presbiteriana de São Paulo, Rev. Eduardo Carlos Pereira, e os líderes do Mackenzie, Horace M. Lane e William A. Waddell.

Com o passar do tempo, o Rev. Eduardo C. Pereira passou a tornar-se mais radical em suas posições, perdendo o apoio até mesmo de muitos dos seus colegas brasileiros. Como uma alternativa ao jornal do Rev. Eduardo, O Estandarte, o Rev. Álvaro Reis criou O Puritano em 1899. Em 1900 foi organizada a Igreja Presbiteriana Unida de São Paulo, que resultou da fusão de duas igrejas formadas por pessoas que haviam saído da igreja do Rev. Eduardo. Na mesma época, um novo problema veio complicar ainda mais a situação: o debate acerca da maçonaria.

Em março de 1902, Eduardo C. Pereira e seus partidários começaram a divulgar a sua Plataforma, com cinco tópicos sobre as questões missionária, educativa e maçônica. Após pouco mais de um ano de debates acalorados, a crise chegou ao seu lamentável desfecho, em 31 de julho de 1903, durante a reunião do Sínodo. Após serem derrotados em suas propostas, Eduardo Carlos Pereira e seus colegas desligaram-se do Sínodo e formaram a Igreja Presbiteriana Independente.